微生物(wù)純培養分(fēn)離技(jì )術

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獲得純培養物(wù)對微生物(wù)學(xué)研究至關重要。

純培養物(wù)是指來源于同一單細胞的細胞群體(tǐ)。

菌種的分(fēn)離純化

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大腸菌種的培養鑒定

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菌種保藏是将微生物(wù)的菌種經長(cháng)時間的保存，不污染其它雜菌，及可(kě)保持其形态特征和生理(lǐ)性狀，減少變異，防止衰老，以便于将來使用(yòng)。保藏菌種一般是選用(yòng)它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要創造一個低溫；幹燥；缺氧；避光和缺少營養的環境條件，以利于休眠體(tǐ)能(néng)長(cháng)期地處于休眠狀态。對于不産(chǎn)孢子的微生物(wù)，應使其新(xīn)陳代謝(xiè)處于最低狀态，又(yòu)不會死亡，從而達到長(cháng)期保存的目的。

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注：
1.乳糖膽鹽液體(tǐ)培養基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液态、鑒别、增值、半合成培養液，實驗中(zhōng)用(yòng)于廢水中(zhōng)菌群的培養；

2.伊紅美藍瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍和瓊脂。瓊脂平闆用(yòng)于分(fēn)離純化腸道緻病菌，特别是大腸菌群和糞大腸菌群；

3.營養瓊脂培養基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用(yòng)于分(fēn)離純化後的菌體(tǐ)培養。

實驗方法和步驟

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1.實驗安(ān)排
實驗準備；
采樣、恒溫培養富集及初篩；
觀察産(chǎn)氣情況及稀釋、倒培養基、劃線(xiàn)、塗布、倒置培養；
鑒定、接種；
菌種保藏。


2.具(jù)體(tǐ)操作(zuò)步驟


實驗準備
①配置培養基(伊紅美蘭瓊脂培養基：7.4g+200mL無菌水、調pH7.2～7.4，營養瓊脂培養基：6.6g+200mL無菌水、調pH7.4±0.2,0.85%生理(lǐ)鹽水、乳糖膽鹽液體(tǐ)培養基2.6g+100mL無菌水，調pH7.4±0.2),，裝(zhuāng)瓶，高壓蒸汽滅菌。

②包紮好培養皿，移液管，試管，進行幹熱滅菌。

③将配好的乳糖膽鹽液體(tǐ)培養基分(fēn)裝(zhuāng)入三個試管中(zhōng)，每個大約十毫升，包紮，滅菌。

④液體(tǐ)石蠟和塗布棒等其他(tā)實驗玻璃器進行滅菌。


采樣、培養
取水，湖(hú)水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體(tǐ)培養基試管中(zhōng)，貼好标簽（采樣時間、人物(wù)、溫度，采樣地點及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養18～24小(xiǎo)時；


觀察産(chǎn)氣情況、稀釋
①觀察産(chǎn)氣管有(yǒu)無氣柱，标記陽性管數。
②樣品稀釋：
對已滅菌的5隻試管編号（分(fēn)别為(wèi)1、2、3、4、5号），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有(yǒu)9mL生理(lǐ)鹽水的試管中(zhōng)為(wèi)1号試管，換一隻移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明标簽。


劃線(xiàn)、塗布
①塗布平闆法：
将已熔化的營養瓊脂培養基倒入無菌平皿，制成無菌平闆，冷卻凝固後，将一定量的含大腸菌群的污水滴加在平闆表面，再用(yòng)無菌玻璃塗棒将菌液均勻分(fēn)散至整個平闆表面，置培養箱中(zhōng)37℃培養24小(xiǎo)時。經培養後挑取單個菌落。


※塗布平闆法操作(zuò)：
1.将塗布器浸在盛有(yǒu)酒精(jīng)的燒杯中(zhōng)；
2.取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養基表面；
3.将沾有(yǒu)少量酒精(jīng)的塗布器在火焰上引燃，待酒精(jīng)燃盡後，冷卻8～10s；
4.用(yòng)塗布器将菌液均勻地塗布在培養基表面。塗布時可(kě)轉動培養皿，使塗布均勻。


注意：
1.将塗布器末端浸在盛有(yǒu)體(tǐ)積分(fēn)數為(wèi)70%的酒精(jīng)的燒杯中(zhōng)。取出時，要讓多(duō)餘的酒精(jīng)在燒杯中(zhōng)滴盡，然後将沾有(yǒu)少量酒精(jīng)的塗布器在火焰上引燃。

2.操作(zuò)中(zhōng)一定要注意防火！不要将過熱的塗布器放在盛放酒精(jīng)的燒杯中(zhōng)，以免引燃其中(zhōng)的酒精(jīng)。）


②平闆劃線(xiàn)法：
經培養後挑取單個菌落，接種環以無菌操作(zuò)沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養基平闆表面進行連續劃線(xiàn)，微生物(wù)細胞數量将随着劃線(xiàn)次數的增加而減少，并逐步分(fēn)散開來，如果劃線(xiàn)适宜的話，微生物(wù)能(néng)一一分(fēn)散。在37℃經培養24小(xiǎo)時後，可(kě)在平闆表面得到單菌落。（有(yǒu)時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反複分(fēn)離多(duō)次才可(kě)得到純種。）


平闆劃線(xiàn)操作(zuò)：

鑒定

觀察EMB平闆，菌落呈紫黑色，具(jù)有(yǒu)或略有(yǒu)金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中(zhōng)心顔色較深，選取符合上述特征的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為(wèi)無芽孢的革蘭氏陰性短杆菌。

 

培養

a.将菌落轉入裝(zhuāng)有(yǒu)玻璃珠的滅菌錐形瓶中(zhōng)調節酸堿度為(wèi)7，充分(fēn)搖勻備用(yòng)。

b.液體(tǐ)發酵：取處理(lǐ)好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體(tǐ)培養基中(zhōng)。搖勻後置培養箱中(zhōng)37℃培養24小(xiǎo)時

 

菌種保藏

①斜面低溫保藏法：

此法為(wèi)最常用(yòng)的一種。一般黴菌；放線(xiàn)菌和有(yǒu)芽孢的細菌可(kě)保存2～4個月，酵母菌可(kě)保存2個月，無芽孢的細菌最好每周移接一次。操作(zuò)過程如下：

a.接種：将要保藏的菌種接入斜面培養基上，試管上貼好标簽，寫上菌種名(míng)稱，時間。

b.培養：各類菌按其所需溫度和時間進行培養。

c.保藏：選取生長(cháng)健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用(yòng)滅菌的塑料包紮好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4℃冰箱中(zhōng)保藏。

 

②液體(tǐ)石臘保藏法：

此法可(kě)用(yòng)不分(fēn)解石臘的菌種保藏。保存時間是半年至一年。放線(xiàn)菌；黴菌和産(chǎn)芽孢菌可(kě)保藏二年。液體(tǐ)石臘可(kě)防止培養基水分(fēn)的蒸發，而引起的菌種死亡。同時可(kě)阻止氧氣進入，防止好氧菌的生長(cháng)。從而延長(cháng)菌種保藏的時間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作(zuò)過程如下

a液體(tǐ)石臘的滅菌：将液體(tǐ)石臘裝(zhuāng)入錐形瓶中(zhōng)，量不超出錐形瓶體(tǐ)積的1/3，塞上棉塞，包紮好後，進行高壓蒸汽滅菌二次（120℃30分(fēn)鍾）。再在110～120℃幹燥箱中(zhōng)蒸發掉蒸汽滅菌時帶入的水分(fēn)。此時石臘透明清亮狀。經檢驗确定無菌後備用(yòng)。

b菌種培養：将所需的菌種經培養後，選取健狀的保藏。

c加石臘油：用(yòng)無菌管吸取石臘油加入菌種試管中(zhōng)，以高出菌種斜面頂點1cm為(wèi)宜。少了會因培養基露出油面，而使培養基變幹造成菌死亡。

d 收藏：試管上部用(yòng)塑料包紮好，垂直立于冰箱中(zhōng)4℃。

e 恢複使用(yòng)：當要使用(yòng)菌種時。傾出石臘油。此石臘油可(kě)再滅菌重複使用(yòng)。接種培養。由于菌體(tǐ)外粘有(yǒu)油。第一次的菌生長(cháng)緩慢，性狀恢複不是很(hěn)好。所以要再移植一次才能(néng)得到良好的菌種。

小(xiǎo)結

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此外，實驗結果記錄應包括：

1．觀察記錄乳糖膽鹽培養基産(chǎn)氣情況。

2．觀察EMB培養基上菌落（包括：形态，質(zhì)地，色澤，上述實驗方案中(zhōng)有(yǒu)具(jù)體(tǐ)說明。）

3．記錄鏡檢結果。