糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)是總大腸菌群中(zhōng)的一部分(fēn)，主要來自糞便。用(yòng)提高培養溫度的方法，造成不利于來自自然環境的大腸菌群生長(cháng)的條件，使培養出來的菌主要為(wèi)來自糞便中(zhōng)的大腸菌群，從而更準确地反映出水質(zhì)受糞便污染的情況。[1]

糞大腸菌群在每個月的地表水例行監測中(zhōng)任務(wù)量較大，采用(yòng)更快速簡便、精(jīng)确的檢測方法十分(fēn)必要。目前國(guó)内地表水的常規監測中(zhōng)，糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)的主要檢測方法是多(duō)管發酵法和濾膜法，其中(zhōng)，多(duō)管發酵法因其檢測周期長(cháng)，步驟冗長(cháng)複雜，假陽性等不利因素，已經面臨淘汰，故濾膜法是現行地表水監測方法中(zhōng)比較快速的檢測方法；而國(guó)外則以固定底物(wù)酶底物(wù)法為(wèi)主，該方法是一種新(xīn)型酶技(jì )術檢測方法，其檢測的高效性受到許多(duō)分(fēn)析人員的青睐。本文(wén)通過比較濾膜法與固定底物(wù)酶底物(wù)法測定地表水中(zhōng)糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)的結果和方法，讨論固定底物(wù)酶底物(wù)法用(yòng)于監測地表水中(zhōng)糞大腸菌群的可(kě)行性。

1 試驗部分(fēn)

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器 CL-32L 高壓全自動滅菌鍋，LRH-280 生化培養箱，IDEXX程控定量封口機，移液器等。

1.1.2 試劑 MFC 培養基，科(kē)立得TM(Colilert®)試劑。

1.2 方法原理(lǐ)

1.2.1 濾膜法

濾膜是一種微孔性薄膜。将水樣注入已滅菌的放有(yǒu)濾膜(孔徑 0.45 µm)的濾器中(zhōng)，經過抽濾，細菌即被截留在膜上，然後将濾膜貼于 M-FC培養基上，44.5 ℃溫度下進行培養，計數濾膜上生長(cháng)的此特征的菌落數，計算出每 1 L水樣中(zhōng)含有(yǒu)糞大腸菌群數。

1.2.2  固定底物(wù)酶底物(wù)法

根據大腸菌群細菌能(néng)産(chǎn)生特異性的 β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase) 分(fēn)解 MMO-MUG 培養基中(zhōng)的色原底物(wù)ONPG(Ortho-nitrophenyl-β-D-glucuronide)使培養液呈黃色，以及大腸埃希氏菌産(chǎn)生特異性的β-葡萄糖酸酶(β-glucuronidase)分(fēn)解MMO-MUG培養基中(zhōng)的熒光底物(wù)MUG(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucronide)使培養液在波長(cháng) 366 nm 紫外光下産(chǎn)生熒光的原理(lǐ)，來判斷水樣中(zhōng)是否含大腸菌群、糞大腸菌群(耐熱大腸菌群)及大腸埃希氏菌。[2]

1.3  樣品來源水樣來源于受污染的地表水，按照《水和廢水監測分(fēn)析方法》

水樣來源于受污染的地表水，按照《水和廢水監測分(fēn)析方法》(第四版)的規定采集，并于 0~4 ℃低溫避光保存，6 h 内進行分(fēn)析。

1.4 試驗方法

本試驗分(fēn)别對 40 個地表水樣品同時進行濾膜法和固定底物(wù)酶底物(wù)法檢測，根據數據判斷兩種方法是否具(jù)有(yǒu)可(kě)比性。

1.5 試驗步驟

1.5.1 濾膜法

對每個樣品分(fēn)别取 10 mL、1 mL、0.1 mL 的水樣量(即做 3個稀釋度的分(fēn)析)，抽濾，将濾膜置于 MFC 培養基表面，緊密蓋好培養皿後，置于44.5±0.5 ℃的恒溫培養箱培養 24±2h；選取培養基上呈藍色或藍綠色的特征菌落計數，然後選擇生長(cháng)有(yǒu)理(lǐ)想菌落數 20~60 個(總菌落數不得超過 200 個)的稀釋度去計算每 1 L水樣中(zhōng)的糞大腸菌群數。

1.5.2固定底物(wù)酶底物(wù)法

用(yòng)100 mL 的無菌取樣瓶量取 100 mL 水樣，加入科(kē)立得TM(Colilert®)試劑，混搖均勻使之完全溶解，将水樣全部倒入 97孔無菌定量盤内，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴内氣泡，用(yòng)程控定量封口機，放入 44.5±0.2 ℃恒溫培養箱中(zhōng)培養 24 h 後，計算有(yǒu)黃色反應的孔穴數，對照 MPN 表查出其代表的糞大腸菌群最可(kě)能(néng)數。

2 結果與讨論

2.1 試驗結果及數據分(fēn)析

2.1.1 試驗結果

本次試驗的地表水樣品共 40 個，由于其中(zhōng) 3 個樣品的結果大于 24196 個/L(即 97 孔定量盤 MPN 表的最大值)，難于對數據進行比較，故此次試驗采用(yòng)其餘 37 個樣品的結果進行比對分(fēn)析，兩種方法的檢測結果見圖 1。

圖 1  兩種方法的糞大腸菌群檢測結果

2.1.2 數據分(fēn)析                

2.1.2 數據分(fēn)析
運用(yòng)軟件 Excel2003，對兩種方法檢測的糞大腸菌群結果進行配對 t 檢驗[3]，為(wèi)了使兩組數據呈正态分(fēn)布，現對數據進行對數處理(lǐ)後再進行 t 檢驗，結果見表1。

由表 1 可(kě)見，泊松相關系數為(wèi) 0.636，屬強相關(系數越趨于 1，相關性越好)，說明兩組數據的相關性很(hěn)好；檢驗統計量 t=0.515，P=0.610＞0.05，說明兩組數據無統計學(xué)意義上的顯著性差異，可(kě)認為(wèi)濾膜法與固定底物(wù)酶底物(wù)法的試驗結果具(jù)有(yǒu)可(kě)比性。

2.2 讨論

(1)在試驗結果方面，通過配對 t 檢驗，此次試驗分(fēn)析得到的兩組數據無統計學(xué)意義上的顯著性差異，說明兩種方法的檢測結果具(jù)有(yǒu)可(kě)比性。

(2)在實驗的前期準備方面，濾膜法需要配制培養基和對大量的玻璃器皿進行滅菌，光是前期的準備時間就需要 3~6 h，而固定底物(wù)酶底物(wù)法則不需要前期準備，隻是需要對封口機進行提前預熱，一般需要 20 min 左右，這種優勢在應急監測中(zhōng)尤為(wèi)明顯。

(3)在實驗操作(zuò)方面，雖然濾膜法相對于多(duō)管發酵法來說，實驗操作(zuò)已經簡便了很(hěn)多(duō)，但相對于固定底物(wù)酶底物(wù)法來說，濾膜法的操作(zuò)還是相對比較繁瑣，需要分(fēn)析人員有(yǒu)大量的實驗經曆才能(néng)提高工(gōng)作(zuò)效率；而固定底物(wù)酶底物(wù)法的操作(zuò)步驟則比較簡單，無需過多(duō)經驗就能(néng)很(hěn)順利地操作(zuò)實驗，同時也由于步驟簡單，在實驗過程中(zhōng)也大大減少了人為(wèi)污染。

(4)在檢測時間方面，濾膜法一般是 24 h，如需确認試驗，檢測時間則需要 48 h，而固定底物(wù)酶底物(wù)法的檢測時間也是 18~24 h，但無需确認試驗。一般來說，兩種方法的檢測時間差别不大，若算上實驗前期準備的時間和實驗後清理(lǐ)器皿的時間，則是濾膜法花(huā)費的時間更多(duō)。

(5)在結果判斷方面，濾膜法在挑選典型菌落讀數時，需要實驗人員有(yǒu)良好的微生物(wù)知識，必要時還要對可(kě)疑菌落進行确認試驗，而固定底物(wù)酶底物(wù)法讀數時對實驗員的專業知識要求不高，而且無需進行确認試驗。

3. 結論

兩種方法的檢測結果具(jù)有(yǒu)可(kě)比性，說明固定底物(wù)酶底物(wù)法可(kě)用(yòng)于地表水中(zhōng)糞大腸菌群的監測。固定底物(wù)酶底物(wù)法具(jù)有(yǒu)操作(zuò)簡單、檢測周期短，前期準備工(gōng)作(zuò)少，對試驗條件和人員要求低，無需确認試驗，易于推廣等優點，已經被世界各國(guó)的國(guó)家及地方實驗室和世界各組織機構如APHA、AWWA、WEF、AOAC、BWA、EBWA、WHO 認可(kě)，在我國(guó)已有(yǒu) 40 餘家供水公(gōng)司、30 餘家疾病預防控制中(zhōng)心、30 餘家環境監測中(zhōng)心及水文(wén)站應用(yòng)。因此，固定底物(wù)酶底物(wù)法替代傳統的多(duō)管發酵法和濾膜法是發展的趨勢。

參考文(wén)獻
[1]《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多(duō)管發酵法和濾膜法(試行)》(HJ/T347-2007)[S]．國(guó)家環境保護總局發布，2007．

[2]高瑞坤，湯琳，付強．水中(zhōng)糞大腸菌群快速檢測方法-固定底物(wù)酶底物(wù)法與多(duō)管發酵法的比較[J]．中(zhōng)國(guó)環境監測，2008，24(4)：39-41．

[3]陳雄新(xīn)，曾建一，陳勇．Excel 在 t 檢驗中(zhōng)的實用(yòng)技(jì )巧[J]．實用(yòng)預防醫(yī)學(xué)，2006，13(1)：202-205．

掃一掃    關注【食安(ān)實彙】

【食安(ān)實彙】公(gōng)衆号由廣州中(zhōng)實生物(wù)科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司運營。中(zhōng)實科(kē)技(jì )緻力于引進食品與環境安(ān)全的檢測新(xīn)技(jì )術。