【摘要】現時檢測水中(zhōng)菌落總數的方法有(yǒu)國(guó)家标準的平皿計數法和地方标準的複合酶底物(wù)法，通過能(néng)力驗證和實驗室間比對，科(kē)學(xué)分(fēn)析少量數據并得出結果，兩種方法的結果均接近樣品真值，其中(zhōng)複合酶底物(wù)法呈現的結果更準确，不需要在無菌條件下操作(zuò)，在實驗室經驗成本條件允許下可(kě)推廣該技(jì )術。使用(yòng)平皿計數法比較兩種不同形态的菌種，結果得出當菌種體(tǐ)積越小(xiǎo)、體(tǐ)液越深，在培養的時候越容易分(fēn)辨個數，得出的結果越準确。

1 引言

菌落總數作(zuò)為(wèi)判定水中(zhōng)被細菌污染程度的标志(zhì)，長(cháng)期作(zuò)為(wèi)常規指标觀察水體(tǐ)中(zhōng)細菌的性質(zhì)和繁殖動态，對水質(zhì)衛生标準提供科(kē)學(xué)依據。

在不同環境、不同操作(zuò)人員、不同使用(yòng)器皿的條件下，菌落總數的結果可(kě)能(néng)會受到影響，因此我們需要進行能(néng)力驗證，去查找在檢驗中(zhōng)是否存在問題，挖掘不足之處進行改進。國(guó)際間的微生物(wù)能(néng)力驗證十分(fēn)成熟，有(yǒu)着十幾年的經驗成果；我國(guó)近年來引進了該系列能(néng)力驗證，包括菌落總數、總大腸菌群、糞大腸菌群、埃希氏菌群、甲第鞭毛蟲、隐孢子蟲等共6項微生物(wù)實驗室間能(néng)力驗證。以上能(néng)力驗證均被國(guó)際認可(kě)，通過驗證的實驗室及操作(zuò)人員可(kě)獲頒證書；存在不足的實驗室，有(yǒu)專業的團隊協助發現問題，改進實驗室條件，以達到符合國(guó)家規定的實驗标準。

2 材料與方法

2.1 培養基和試劑

适用(yòng)于《生活飲用(yòng)水标準檢驗方法 微生物(wù)指标》GB/T 5750.12-2006 1.1平皿法計數中(zhōng)的培養基，廣東環凱微生物(wù)科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司生産(chǎn)的營養瓊脂培養基。

适用(yòng)于《水中(zhōng)菌落總數符合酶底物(wù)檢測方法》DB44/T 1163-2013中(zhōng)的培養基套裝(zhuāng)，包含SimPalte 100mL瓶裝(zhuāng)無菌培養基和84孔穴樣品盤。

2.2 實驗儀器

恒溫生化培養箱、高壓滅菌鍋、便攜式紫外燈

2.3 實驗方法及原理(lǐ)

2.3.1 樣品處理(lǐ)

将樣品凍存管從冰箱中(zhōng)取出，于室溫下平衡10至15分(fēn)鍾。将100毫升無菌水倒入無菌取樣瓶中(zhōng)。打開樣品凍存管，将有(yǒu)顔色的圓形膠盤無菌操作(zuò)轉移到裝(zhuāng)有(yǒu)無菌水的取樣瓶中(zhōng)，充分(fēn)振蕩後靜置10至15分(fēn)鍾，直至圓形膠盤完全溶解，得到待檢測的樣品原液。

盲樣需再取90毫升無菌水倒入另一無菌取樣瓶，取10毫升樣品原液轉移到90毫升無菌水中(zhōng)，充分(fēn)混合，得到待檢測的10倍稀釋度樣品。

從樣品接觸無菌水到完成檢測，全過程在45分(fēn)鍾内完成。

2.3.2 平皿計數法

滅菌移液管吸取1毫升樣品，注入滅菌平皿中(zhōng)，傾注月15毫升已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使樣品與培養基充分(fēn)混勻。凝固後倒置放入36℃±1℃培養箱内，培養48小(xiǎo)時。

質(zhì)控樣品原液、盲樣樣品原液、盲樣10倍稀釋樣品等各做5個平行接種，合共3組樣品。同時對營養瓊脂和1毫升無菌水各做1個空白對照。

2.3.3 複合酶底物(wù)法

滅菌移液管吸取1毫升樣品和9毫升培養基加入到樣品盤中(zhōng)心，蓋上樣品盤蓋子，輕輕轉動樣品盤将液體(tǐ)分(fēn)配到每個孔穴中(zhōng)。然後慢慢将盤子豎起90°至120°，将多(duō)餘的液體(tǐ)吸到樣品盤中(zhōng)的還買上。把樣品盤緩慢倒置，放入36℃±1℃培養箱内，培養48小(xiǎo)時。

已知盲樣樣品原液濃度在該方法上限值738MPN/mL範圍内，故隻需使用(yòng)原液做5個平行接種，合共1組樣品。用(yòng)10毫升培養基做1個培養基空白，用(yòng)1毫升無菌水代替樣品做1個純水空白對照。

3 結果讨論

3.1 兩個方法菌落總數生長(cháng)情況

每5個平行樣為(wèi)一組的樣品，以樣品轉移到平皿或樣品盤的時間為(wèi)排序方式，在45分(fēn)鍾内完成整個操作(zuò)過程，4組樣品中(zhōng)均沒有(yǒu)出現随時間變化而有(yǒu)規律性的結果變化。具(jù)體(tǐ)結果如表1。

在檢驗結果的可(kě)信度時，通過質(zhì)控樣結果，可(kě)判斷在此次實驗操作(zuò)過程中(zhōng)測量值的準确性是可(kě)信的。

在選取有(yǒu)效結果數值時，因每組樣品的樣品量較少，且微生物(wù)培養結果的允許限值跨度較大，通常在檢驗微生物(wù)結果時，取二倍相對偏差為(wèi)合理(lǐ)範圍，對應此次實驗結果，各組樣品結果均在合理(lǐ)範圍之内，直接求得平均值得出最終結果。

在選擇平皿計數法中(zhōng)是否稀釋過的樣品作(zuò)為(wèi)最終結果時，按照GB/T 5750.12-2006 1.1.7的要求，“首先選擇平均菌落數在30~300之間者進行計算”，但是，根據實際情況，對平皿的觀察與比較，盲樣中(zhōng)的菌落形狀較小(xiǎo)、輪廓清晰、分(fēn)布均勻、數量可(kě)計數，同時考慮到通過二次稀釋，可(kě)能(néng)将外來菌種帶到樣品中(zhōng)造成結果偏高，故最終結果選取不經稀釋的培養皿進行計數與結果上報。

3.2 質(zhì)控樣品與考核樣品菌種大小(xiǎo)、形狀的對比

在相同的200倍顯微鏡放大後觀察質(zhì)控樣和盲樣菌種大小(xiǎo)及形狀，質(zhì)控樣品最長(cháng)直徑較大、整體(tǐ)呈橢圓形、兩頭較圓、菌種有(yǒu)透光性、濃度較高的時候培養效果容易結團連成一片；盲樣最長(cháng)直徑是質(zhì)控樣的25%、整體(tǐ)呈尖錐形、兩頭較尖、菌種透光度較低、濃度較高時候培養效果清晰可(kě)辨、不容易結塊結團。

4 小(xiǎo)結

微生物(wù)比對在國(guó)内處于起步階段，每年全國(guó)性的微生物(wù)實驗室間比對規模越來越大，認可(kě)度越來越廣，對實驗室能(néng)力要求也越來越高。

對于平皿計數法與複合酶底物(wù)法優越性比較，平皿計數法是傳統的檢測方法，低成本、應用(yòng)時間長(cháng)、技(jì )術成熟，對操作(zuò)環境的衛生條件要求高，需要在無菌室内操作(zuò)；複合酶底物(wù)法是近年開法出來的新(xīn)方法，操作(zuò)簡單，在普通的實驗室内也可(kě)以進行培養，多(duō)次質(zhì)控樣的結果，複合酶底物(wù)法比平皿計數法更接近樣品真值，但實驗用(yòng)的培養基培養皿等材料成本較高。

無論選取何種方法，若要做好實驗室間比對，前期準備工(gōng)作(zuò)至關重要。對恒溫培養箱48小(xiǎo)時的恒溫觀察記錄、對實驗用(yòng)具(jù)的清潔消毒、對培養基的儲存與配制，還有(yǒu)就是多(duō)次練習提升操作(zuò)速度，從而能(néng)在規定的菌種活性有(yǒu)效時間内多(duō)做幾組平行樣。

參考文(wén)獻

[1] 肖劍, 李慧琴, 陳楷, 等. 食品微生物(wù)能(néng)力驗證樣品菌落總數檢驗方法 [J]. 食品安(ān)全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2014, 10(5): 3343-3348.

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