【菌株保存要求】

菌種作(zuò)為(wèi)一項重要的生物(wù)資源，對微生物(wù)學(xué)教學(xué)和研究是必不可(kě)少的。菌種保存方法因微生物(wù)的不同而異。在菌種保存過程中(zhōng)，必須使微生物(wù)的代謝(xiè)處于最不活躍或相對靜止的狀态，才能(néng)在一定的時間内不發生變異而又(yòu)保持生活能(néng)力。低溫、幹燥和隔絕空氣是使微生物(wù)代謝(xiè)能(néng)力降低的重要因素，故菌種保存方法多(duō)依據這三個因素而設計。菌種保存方法有(yǒu)多(duō)種，最理(lǐ)想的為(wèi)真空冷凍幹燥法，具(jù)有(yǒu)保存時間長(cháng)、成活率高、變異小(xiǎo)等優點，但操作(zuò)技(jì )術難度大，花(huā)費高，需特殊設備，一般單位不易做到，而一些常規方法，常因傳代次數多(duō)、易污染、易變異，給保存帶來諸多(duō)不利。多(duō)年來，微生物(wù)學(xué)工(gōng)作(zuò)者們一直在研究摸索簡便而行之有(yǒu)效的菌種保存方法，筆(bǐ)者查閱相關資料并吸取同行工(gōng)作(zuò)者們的實踐經驗，總結了幾種方法簡便、效果好的保存方法，現介紹如下。

需要4℃冰箱保存的保存法

1.液體(tǐ)石蠟保存法

先将液體(tǐ)石蠟滅菌，然後放于37℃恒溫箱中(zhōng)，使水汽蒸發掉備用(yòng)。再将需要保存的菌種在最适宜的斜面培養基中(zhōng)培養，用(yòng)無菌吸管吸取已滅菌的液體(tǐ)石蠟，注入已長(cháng)好的斜面培養基上，用(yòng)量以高出斜面頂端1cm 為(wèi)準。試管需直立，置4℃或室溫下保存，一般無芽胞細菌可(kě)保存1年左右。

2.高層半固體(tǐ)瓊脂石蠟保存法

将需保存的菌種經平闆劃線(xiàn)分(fēn)離後，挑單個菌落用(yòng)接種針反複穿刺接種到高層半固體(tǐ)瓊脂培養基中(zhōng)，經37℃12小(xiǎo)時培養後取出，用(yòng)無菌操作(zuò)将滅菌的液體(tǐ)石蠟滴加半固體(tǐ)瓊脂菌種管表層約0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年轉種1次。

3.蒸餾水保存法

取滅菌蒸餾水6～7mL加于試管斜面上，用(yòng)吸管研磨，洗下菌苔充分(fēn)混勻，将此菌液分(fēn)裝(zhuāng)于滅菌的螺旋小(xiǎo)瓶中(zhōng)，或用(yòng)膠塞密封，置4℃保存可(kě)存活數年。

需-20℃冰箱冷凍保存的保存法

1.甘油保存法

甘油一生理(lǐ)鹽水保存液的制備：

取甘油(分(fēn)析純)8份加入生理(lǐ)鹽水2份，充分(fēn)混合後，經121.3℃，30分(fēn)鍾滅菌備用(yòng)。

将純化後的菌株根據菌種不同分(fēn)别劃線(xiàn)接種于其最适宜生長(cháng)的培養基上培養後，用(yòng)接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養6～8小(xiǎo)時（鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管，5～10%CO2環境下8～10小(xiǎo)時培養，真菌直接用(yòng)接種環取菌洗入肉湯管，不培養）。此為(wèi)培養液。

将此培養液與保存液以5：2的比例混合分(fēn)裝(zhuāng)于滅菌的微量離心管，置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用(yòng)時需37℃水浴中(zhōng)快速解凍。

用(yòng)上述方法保存一般菌株可(kě)存活3年以上，鏈球菌、奈瑟菌可(kě)存活12～15個月，且性狀未發生變異。此方法采用(yòng)幼齡肉湯培養物(wù)效果好，且适用(yòng)于鏈球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

2.低溫保存法

菌種保存液的配制：K2HPO412.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸餾水至1000mL，103.4KPa滅菌30分(fēn)鍾，4℃保存備用(yòng)。

将細菌接種于肉湯培養基中(zhōng)，37℃ 培養16～18小(xiǎo)時，或斜面培養物(wù)刮取于生理(lǐ)鹽水中(zhōng)，然後加入等體(tǐ)積的菌種保存液，凍存于-70℃或-20℃冰箱中(zhōng)。

此方法也适合甲鏈、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、綠膿杆菌等耐受力低的細菌。-70℃保存10年以上，-20℃可(kě)保存2年以上。

3.細菌濕種牛奶凍存法

新(xīn)鮮牛奶或15%奶粉煮沸，冷卻脫脂，分(fēn)裝(zhuāng)小(xiǎo)試管，每管1mL，8磅15分(fēn)鍾滅菌備用(yòng)。

将純種菌接種于平闆，37℃16小(xiǎo)時培養，以接種環刮取菌苔2-3環于牛奶中(zhōng)混勻，試管用(yòng)矽膠塞，凍存于普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用(yòng)時取出室溫溶解，待部分(fēn)溶解時即可(kě)取一環接種平闆，并将試管再迅速凍存，這樣可(kě)反複使用(yòng)3-5次。此法一般菌株可(kě)存活48個月，少數如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可(kě)存活14-30個月。

4.甘油原液保存法

将各待保存的菌種純化後用(yòng)接種環直接從平闆上刮取，置于盛有(yǒu)0.5mL甘油原液的菌種瓶中(zhōng)，-20℃保存，可(kě)連續52個月存活良好。

此法尤其适合乙鏈、破傷風杆菌、産(chǎn)氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種，是一種簡便實用(yòng)的有(yǒu)效保存方法。

需低溫-30或-70℃冰箱保存的保存法

1. 脫纖維羊血

無菌抽取羊頸靜脈血後，沿瓶壁注入無菌的帶玻璃的三角燒瓶中(zhōng)，同時立即同一方向振搖約8～10分(fēn)鍾，脫去纖維，然後分(fēn)裝(zhuāng)加蓋無菌小(xiǎo)試管中(zhōng)約1.0～1.5mL。

将腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分(fēn)别接種于血平闆培養基中(zhōng)，前兩者置于5～10% CO2燭缸内，經35℃16～18小(xiǎo)時培養，後三者置37℃恒溫箱培養24小(xiǎo)時，然後無菌操作(zuò)取一接種環菌苔移種于上述新(xīn)鮮脫纖維羊血試管中(zhōng)，立即置-30℃冰凍保存二年轉種一次。用(yòng)時室溫自然冰融即可(kě)接種。

2. 紙片法

新(xīn)華定性濾紙剪成4mm×4mm，1.5mL帶蓋離心管消毒滅菌備用(yòng)，用(yòng)消毒小(xiǎo)鉗子鉗上濾紙片于平闆上刮取待保種的純菌落2～3個。放于離心管内塞蓋再用(yòng)封口膠布将蓋邊緣封好放于-30℃冰箱保存。保存12個月後取出菌種解凍後用(yòng)無菌鉗取一片放于肉湯管内37℃培養12小(xiǎo)時後轉種血平闆，性狀未變異。

3. 奶粉液菌種保存法

菌種保存液：脫脂奶粉10g，NaCl 10.5g，加雙蒸水100mL，121℃ 5分(fēn)鍾高壓滅菌後分(fēn)裝(zhuāng)于1mL帶蓋無菌标本杯中(zhōng)(0.5mL)備用(yòng)。

無菌操作(zuò)用(yòng)4mm×10mm 無菌濾紙條蘸取新(xīn)鮮菌少許，放存含奶粉液保存杯中(zhōng)，蓋好，封口膠封口，低溫保存。3年存活率達99.2% 。

使用(yòng)時将标本杯取出，不等全部融化，上層有(yǒu)少許融化即用(yòng)接種環取一少許接種于血平闆分(fēn)離即可(kě)。

結論

菌種是細菌工(gōng)作(zuò)中(zhōng)所不可(kě)缺少而又(yòu)具(jù)有(yǒu)傳染性生物(wù)學(xué)因子。為(wèi)了保證工(gōng)作(zuò)和安(ān)全，對菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死，還要求其生物(wù)學(xué)性狀、生理(lǐ)特性、抗原性等方面不發生變異，這是保存菌種的重要環節。延長(cháng)菌種存活期應注意：首先，待保存菌種須選擇生長(cháng)期幼齡培養物(wù)，且制成濃菌液保存，以保證存活率。其次，高層半固體(tǐ)培基最好選擇不含或含糖量低的培基，可(kě)減少或避免因代謝(xiè)産(chǎn)物(wù)産(chǎn)生而造成的細菌死亡。最後，保存溫度的高低可(kě)影響存活率，切忌反複凍融。以上介紹的幾種方法，取材簡單，操作(zuò)容易，已經反複實踐證明保存時間長(cháng)，變異小(xiǎo)，适合中(zhōng)小(xiǎo)型實驗室使用(yòng)。